ELISA

ELISA (z ang. enzyme-linked immunosorbent assay, tiež EIA) je metóda, diagnostický test, ktorý sa používa na zistenie, či určitá protilátka alebo antigén je prítomný u pacienta. Na vykonanie testu je potrebná vzorka pacientovej krvi. Touto metódou nie je možné zistiť lokalizáciu protilátok.

ELISA je jednou z najpoužívanejších imunologických metód slúžiacich k detekcii protilátok. Metóda funguje na báze imunoenzymatickej reakcie a možno s ňou tiež detekovať aj antigén. ELISA využíva dve základné vlastnosti imunoglobulínov. Po prvé je to schopnosť proteínov (teda imunoglobulínov) viazať sa na povrch plastov (napr. polystyrénu) a v druhom rade potom schopnosť viazať enzýmy na Fc fragmenty (viď. protilátka) imunoglobulínových molekúl.

Modifikácie ELISA testu

Pre dôkaz špecifických protilátok aj antigénov existuje široké spektrum rôznych modifikácií ELISA testu:

• Priama ELISA - pre detekciu antigénu
• Nepriama ELISA - pre DETEC špecifických protilátok
• Priama sendvičová ELISA - pre detekciu antigénu
• Nepriama sendvičová ELISA - pre DETEC špecifických protilátok

Základné zložky ELISA testu:

Antigén

• Detekovaný v testovanej vzorke
• Známy, komerčne pripravovaný

Protilátka

• Detekovaná v skúšobnom sére
• Známa, komerčne pripravovaná

Konjugát

• Jedná sa opäť o protilátku proti protilátke (konkrétne proti druhovo špecifickým imunoglobulínom príslušného izotypov (proti IgG, IgM, IgA, pozri protilátka), na ktorú je naviazaný enzým (konjugovaná enzýmom)

Substrát

• Je chemická látka, ktorá reaguje s enzýmom a tým zmení svoju farbu

Výhody

V porovnaní s inými imunologickými metódami existuje mnoho výhod ELISA. Výsledky pri ELISA testovaní sú omnoho presnejšie a sú považované za vysoko senzitívne a špecifické a pri testovaní sa nemusia používať rádioizotopy (rádioaktívne látky) pri testovaní.

• vysoká citlivosť (senzitivita)
  • je to pravdepodobnosť, že výsledok bude pozitívny
  • citlivosť sa hodnotí zvyčajne od 0-10 alebo v %
  • vyjadruje sa úspešnosť, pri ktorej sa zachytí prítomnosť sledovaného ochorenia
• vysoká špecifickosť
  • špecifickosť sa posudzuje vzhľadom k schopnosti selekcie protilátky alebo antigénu
  • je to pravdepodobnosť negatívneho negatívneho výsledku u zdravej osoby
  • vyjadruje schopnosť testu nájsť prípady, u ktorých sa ochorenie nevyskytuje

Priestorové vybavenie

Na vyšetrovanie pomocou ELIDA metódy je potrebné zariadenie, ktoré sa nazýva ELISA reader. Je to velký spektrofotometer, který dokáže merať zmeny farieb pri chemických reakciách. Tieto prístroje sa neustále vylepšujú, aby boli výsledky testov čo najpresnejšie.

Postup

• Na povrch polystyrénovej jamky je naviazaný antigén. Sérum, v ktorom hľadáme protilátky pridáme do jamky. Ak v sére je protilátka, naviaže sa na antigén, ktorý je pevne na povrchu jamky. Nenaviazanú protilátku odplaví při premývaní voda.
• Pridáme ďalšiu protilátku (komerčnú označenú farbičkou, alebo enzýmom, ) proti hľadanej protilátke v sére. Ak je naviazaná na platničku cez antigén, naviaže sa aj komerčná protilátka.
• Túto potom môžme detekovať podľa zmeny farby.

Pri ELISA testovaní sa stanovujú:

• autoprotilátky- protilátky, ktoré napádajú bunky vlastného organizmu
• špecifické protilátky, ktoré sa vytvořili proti očkovacím antigénom, proti infekčným činiteľom (baktérie, vírusy a parazity)
• cytokíny- sú to látky, ktoré regulujú rast buniek, ich dozrievanie a delenie, ich hodnoty sú zvýšené aj pri zápalech

Základom vyšetrenia je hodnotenie a stanovenie protilátok a antigénov vo vzorke. Protliátky sú súčasťou imunitnej reakcie, sú to bielkoviny, ktoré produkuje organizmus v obrannej reakcii proti škodlivým látkam (antigénom). Protliátky teda bojujú proti určitým antigénom. Metódy na zisťovanie protilátok sa neustále zlepšujú a tak sa presne dokáže zistiť kvalita kvantita skúmanej protilátky. Protilátka sa vždy naviaže na antigen, vytvárajú spolu komplex.

ELISA je analytická metóda, ktorá sa využíva k stanoveniu rôznych antigénov. Metóda zahŕňa viac reakcií, ale všetky typy reakcií sú založené na spojení protilátky a antigénu, pričom na jeden z týchto substrátov sa naviaže enzým. Enzým ovplyvňuje chemickú reakciu tak, že zmení farebný výsledok.

Pri štandardnej sendvičovej ELISE sa zisťuje koncentrácia antigénu:

• najprv sa na dno naviaže skúmaná protilátka, na ktorú sa má potom naviazať antigen, který chceme nájsť a dokázať vo vzorke
• pridanie vzorky- v tejto fáze vyšetrenia sa vytvára väzba medzi antigénom a protilátkou iba vtedy, ak ide o hľadaný antigen
• po vytvorení tejto väzby sa odmyje nenaviazaný antigen
• následne sa pridá druhá protilátka, ktorá tiež dokáže naviazať antigen, ale na tejto protilátke je naviazaný enzým, který farebne zmení výsledok
• po ukončení reakcie sa vyhodnotia výsledky

Názov sendvičová je preto, lebo antigén je ako v sendviči medzi dvomi protilátkami. Táto reakcia sa dá uskutočniť aj obrátene, čiže hľadá sa protilátka proti známemu antigénu.

Praktické použitie

Metódy ELISA sa využívajú k diagnostike infekčných chorôb človeka a zvierat. Stanovujú sa buď protilátky proti konkrétnemu patogénu alebo sa detekujú priamo prionovej, vírusové, bakteriálne, parazitárne antigény. Ďalej sa používajú na detekciu niektorých toxínov, hormónov, celej rady proteínov, prípadne ďalších bioaktívnych látok. Vedci pracujú aj na vývoji metód ELISA pre kozmický výskum, napríklad na detekciu foriem života na Marse.

ELISA test sa môže použiť na diagnózu následovných ochorení:

• HIV vírus- stanovaje sa množstvo protilátok, ktoré bojujú proti vírusu HIV
• lymfská choroba
• perniciózna anémia
• rotavírusy
• rakovina- pri rakovine sa detekujú markery
• syfilis
• toxoplazmóza
• pomocou tejto metódy sa môže odhaliť aj nelegálne užívanie drog, taktiež sa môžu odhaliť rôzne alergické reakcie na potraviny, ako napr. orechy a mliečne produkty.

Tento test doporučuje lekár pri podozrení na určité ochorenie. Test sa robí aj u tehotných žien, kedy sa robí skríning na HIV. Pomocou tejto metódy sa dajú dokázať aj protilátky proti spermiám u mužov a tak sa môže zistiť príčina neplodnosti.

Príprava na vyšetrenie

Na vyšetrenie sa pacient nemusí nijako pripraviť. Na vyšetrenie je potrebná vzorka krvi, ktroá sa odoberie od pacienta. Niektorí pacienti majú strach z odberov krvi, preto by mali predtým informovať lekára, aby o tom vedel.

Riziká

Existuje len veľmi malé množstvo rizík, ktoré sú spojené s týmto testom. Žily sa líšia u každých pacientov, preto odber krvi môže byť u niektorých pacientov obtiažny.

Riziká sú spojené jedne s odberom krvi a medzi ne patrí:

• nadmerné krvácanie
• nevoľnosť, pocit na odpadnutie
• hematóm- hromadenie krvi pod kožu (modrina)
• infekcia

Výsledky

Pomocou ELISA testu sa zistí hladina koncentrácia antigénu alebo protilátky, zistí sa, či je daná koncentrácia v norme alebo nie. Na základe sa test vyhodnotí ako pozitivny alebo negatívny. Vzhľadom k tomu, že ELISA testy sú veľmi specifické a spoľahlivé, lekári tak môžu diagnostikovať ochorenia jako HIV, dá sa identifikovať alergia alebo potvrdiť tehotenstvo.

Reprodukčná imunológia

Diagnostikou a liečbou imunologických porúch neplodnosti sa zaoberá lekársky odbor reprodučná imunológia. Zoznam reprodukčných imunológov nájdeš v samostatnom článku: Reprodukčná imunológia

Viac o teste ELISA na modrykonik.sk

• Diskusia (CZ a SK): Môže byť IGG ELISA 2400 príčinou potratu?

Použité zdroje

1. http://cs.wikipedia.org/wiki/ELISA